SPITALUL CLINIC COLENTINA
Proiect de cercetare PED 141

Activitati


PED141

Rolul microparticulelor in mecanismele patogenetice ale complicatiilor vasculare la pacientii cu mieloproliferari cronice

Obiective

          In acest proiect ne propunem stabilirea unor corelatii intre existenta in cantitate crescuta a microparticulelor (MPs) la pacienti cu neoplasme cronice mieloprolifeative (MPNs) prezentand risc trombotic ridicat. Identificarea precoce a acestor pacienti este foarte importanta pentru deciziile de tratament citoreductiv.

          In cursul implementarii proiectului vom utiliza un ansamblu de tehnici moleculare si de metode biofizice de studiu pentru a evalua activitatea plachetara si proprietatile membranare ale acestora, prezenta si proprietatile MPs in sangele pacientilor cu MPNs.

Aceste date experimentale vor fi corelate cu scorurile de risc trombotic asa cum sunt ele determinate prin procedurile hematologice standard.

Etapa 1: 03.01.2017-29.12.2017

S-au indeplinit activitatile dedicate etapei 1 din Planul de realizare dupa cum urmeaza:

          1. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate pentru recoltarea sangelui de la persoane sanatoase si pacienti cu mielodisplazii

Includerea in studiu a persoanelor sanatoase si a pacientilor s-a realizat in baza unui Protocol de criterii de includere/excludere in urma unui consimtamant informat (fiecare persoana a primit in forma printata Instiintare pacient despre studiul PARTE-MPN si Consimtamant de participare la studiul PARTE-MPN). Recoltarile de probe sangvine s-au realizat de catre personal autorizat la spitalul Colentina. In urma unor procesari standard probele sangvine au fost transferate catre Partenerul P1 si/sau folosite pentru masuratori experimentale specifice.

          2. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate pentru prepararea plasmei bogate in plachete si a plasmei bogate in microparticule

Pentru realizarea masuratorilor de agregare plachetara, de evaluare a statusului oxidativ si a rigiditatii membranelor plachetare a fost necesara obtinerea de plasma bogata in plachete (PRP). Parametrii de lucru au fost optimizati pentru probe sangvine provenind de la pacienti cu numar foarte variabil de plachete circulante din cauza patologiilor mielodisplazice specifice. Similar a fost standardizata procedura de obtinere a plasmei bogate in microparticule (MRP). Cele doua tipuri de plasma PRP si MRP sunt necesare testelor de identificare flow-citometrica a receptorilor in plachete si microparticule, dar si pentru identificarea parametrilor PAI-1, 4G-4G, MTHFR 677TT, V Leiden 506Q si a mutatiei 20210A protrombinice.

          3. S-a stabilit un protocol standardizat de masurare a agregarii plachetare

Inregistrarea unei curbe de agregare plachetara prin utilizarea de variati agonisti (ADP, colagen, epinefrina, ristocetina) presupune o proba biologica cu anumiti parametrii de calitate (timp scurs de la recoltare, densitate optica, proba blanc decelularizata din plasma aceluiasi pacient, stocuri de agonisti etc). S-a optimizat procedura de lucru pentru obtinerea curbelor de agregare din PRP provenind de pacienti cu diverse patologii mielodisplazice.

          4. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate de identificare flow citometrica a receptorilor in plachete si microparticule

Pentru realizarea unei identificari flow citometrice de calitate trebuiesc optimizati o serie de parametrii legati de identificarea semnalului specific, obtinerea unui raport bun semnal/zgomot, realizarea fluxurilor de manipulare a plachetelor care sa nu duca la activarea mecanica a trombocitelor, identificarea si indepartarea semnalelor fluorescente fals positive, Raportarea la controale corecte din punct de vedere al receptorilor si semnalelor de fluorescenta, delimitarea semi-automatizata a populatiilor celulare samd. Toate aceste optimizari au fost realizate pentru probe provenind de la pacienti cu diverse patologii mielodisplazice.

          5. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate de identificare a PAI-1, 4G-4G, MTHFR 677TT, V Leiden 506Q si a mutatiei 20210A protrombinice

Activitatea de testare genetica a fost realizata in cadrul Laboratorului de Genetica Moleculara din cadrul Disciplinei de Genetica Medicala a UMF Carol Davila care dispune de toate echipamentele necesare activitatilor de analiza moleculara.

          6. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate pentru evaluarea statusului oxidativ al membranelor plachetare

Evaluarea statusul oxidativ al plachetelor presupune o abordare complexa prin metode combinate fluorescente si chemiluminometrice. Plachetelor au fost pregatite pentru aceste masuratori prin separare cromatografica pe coloana de sepharose, metoda de separare foarte prietenoasa pentru membranele trombocitare. S-au optimizat parametrii de lucru pentru asigurarea unui semnal de intensitate corespunzatoare domeniului liniar de lucru al kit-urilor specifice, realizarea unor probe control de tip pozitiv sau negativ corespunzatoare fiecarui pacient samd.

          7. S-au stabilit protocoale de lucru standardizate pentru masurarea rigiditatii membranelor plachetare

Parametrul rigiditate membranara cuantifica gradul de fluiditate a bistratului lipidic al membrane celulare. Activitatea proteinelor inserate in membranele celulara (receptori sau pompe sau alte categorii) este modulata de gradul de libertate si de organizare locala a lipidelor membranare. Acest parametru a fost evaluat prin masuratori de anizotropie de fluorescenta cu ajutorul unui fluorofor specific TMA-DPH. Protocolul a fost standardizat pentru plachete provenind din PRP, plachete supuse unor etape de spalare in solvent specific de tip tyrode.

          8. Protocoalele au fost testate si validate pe probe biologice de la pacienti cu diverse patologii mielodisplazice si au fost corelate intre parteneri in vederea optimizarii strategiei experimentale

          9. Diseminarea rezultatelor s-a realizat cu success la 9 congrese nationale si internationale de specialitate, de prestigiu din Romania, Eurpa si Statele Unite ale Americii

 

 Anexa 1 - RTS Etapa 1 Bibliografie

 Poster 1 (10th International Congress on Myeloproliferative Neoplasms and Chronic Myeloid Leukemia, New York, USA, November 2017)

 Poster 2 (10th International Congress on Myeloproliferative Neoplasms and Chronic Myeloid Leukemia, New York, USA, November 2017)

 Poster 3 (22th EHA Congress, Madrid, Spain, June 2017)